• лечения рака молочной железы
  • выявление рака у мужчин
  • лечения рака легки
  • выявление рака у женщин
  • лечения мультиформной глиобластомы головного мозга
  • Инновационные биотехнологии
    лечения рака молочной железы

    Подробнее
  • Скрининг и раннее
    выявление рака у мужчин

    Подробнее
  • Инновационные биотехнологии
    лечения рака легких

    Подробнее
  • Скрининг и раннее
    выявление рака у женщин

    Подробнее
  • Инновационные биотехнологии
    лечения мультиформной глиобластомы головного мозга

    Подробнее

Нейровита онкология

Технологии клиники НейроВита для лечения рака и глиобластомы

Наша клиника — одно из ведущих частных медицинских учреждений Москвы, специализирующихся на лечении онкологии.

Подробнее

Нейровита неврология

Технологии клиники НейроВита для лечения нервных болезней

Мы способны реабилитировать пациентов любой степени тяжести и из любой страны.

Подробнее

10.05.2005 год Восстановительная терапия тяжелых повреждений спинного мозга крыс с использованием Сферогель-Э. Российская академия медицинских наук ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН.

В 2001 г. по инициативе директора Научно-исследовательского института трансплантологии и искусственных органов (НИИТиИО) Минздрава РФ академика Валерия Ивановича Шумакова и работающего в это время в НИИТиИО д.м.н., профессора Андрея Степановича Брюховецкого в Центре по исследованию биоматериалов (руководитель д.б.н. профессор Виктор Иванович Севастьянов) были начаты работы по разработке и исследованию биологической безопасности биодеградируемых биополимерных матриксов, предназначенных для трансплантации в зоны повреждения органов и тканей стволовых клеток или соответствующих незрелых функционирующих клеток.
Одним из результатов работы явилось создание на основе коллагенсодержащего геля трехмерного матрикса, защищенного в 2003 г. торговым знаком СферовГЕЛЬ.
Основной недостаток коллагеновых гелей - быстрая их биодеградация при имплантации. В результате происходит только частичное восстановление исходной ткани с формированием рубцовой ткани.
Авторам ноу-хау технологии производства СферовГЕЛЬ профессору В.И. Севастьянову и заведующей испытательной лаборатории биологической безопасности медицинских изделий Центра по исследованию биоматериалов к.б.н. Надежде Викторовне Перовой удалось существенно уменьшить скорость биорезорбции гидрогеля за счет формирования в нем микрогетерогенной структуры. Конечный продукт СферовГЕЛЬ представляет собой находящуюся в инсулиновом шприце стерильный прозрачный гель с набухаемостью по воде - 87+5 %, содержащий комплекс биологически активных веществ, стимулирующий дифференциацию и пролиферацию клеток. Время биодеградации СферовГЕЛЬ можно варьировать от нескольких недель до нескольких месяцев.
Исследования физико-химических и биологических свойств СферовГЕЛЬ были проведены под руководством Н.В. Перовой в Испытательной лаборатории по специально разработанной программе испытаний имплантируемых матриксов для клеточной трансплантации. Было доказано, что СферовГЕЛЬ отвечает требованиям, предъявляемым к имплантатам стандартом ГОСТ Р ИСО 10 993, и может быть использован в качестве субстрата для функционирующих клеток.
Проведенный затем комплекс исследований биофункциональности СфероТГЕЛЬ в экспериментах на животных возглавил профессор А.С. Брюховецкий, являющийся в настоящее генеральным директором созданной им клиники восстановительной интервенционной неврологии и терапии "НейроВита", Москва.
В январе 2004 г. на заседании Ученого Совета Российского государственного медицинского университета (протокол № 6 от 26 января 2004 г.) было принято решение рекомендовать проведение ограниченных клинических исследований технологии имплантации биодеградируемого полимера СферовГЕЛЬ с аутологичными стволовыми клетками в клинике "НейроВита". В апреле 2004 г. решение о проведении в ГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов клинических исследований биодеградируемого полимера СферовГЕЛЬ с аутологичными кардиомиоцитоподобными клетками было принято на заседании Ученого Совета этого Института.

Реферат

Ключевые слова:Сферогель-Э, спинной мозг, острая травма, трансплантация, терапия повреждений спинного мозга, двигательные нарушения.
Объекты исследований: препарат Сферогель-Э.
Цель и задачи исследования:Разработка метода восстановительной терапии тяжелых повреждений спинного мозга с использованием Сферогеля-Э.

Задачи исследования:

  1. Создание модели острой травмы спинного мозга
  2. Замещение дефекта спинного мозга трансплантатом отечественного производства "Сферогель-Э"
  3. Замещение дефекта спинного мозга трансплантатом отечественного производства "Сферогель-Э" с эмбриональными клетками
  4. Оценка тактильной чувствительности и двигательной активности задних конечностей у оперированных животных
  5. Иммуногистохимическое исследование

Методы исследования: современные методы экспериментальной нейрохирургии, биологии и онкологии.

Аппаратура, реактивы и прочее: Стандартное оборудование и набор реактивов, используемые при нейрохирургических операциях: микрохирургический инструмент, средства для наркоза животных, антибактериальные и антисептические средства, перевязочный материал. Стандартное оборудование и набор реактивов, используемые для иммуногистохимических исследований.

Полученные результаты: По договору "Восстановительная терапия тяжелых повреждений спинного мозга крыс с использованием Сферогеля-Э"

  1. Освоена методика хирургического повреждения спинного мозга крыс (удаление участка спинного мозга после рассечения на уровне 10 позвонка грудного отдела позвоночника)
  2. Проведено хирургическое повреждение спинного мозга у 72 крыс (острая модель повреждения спинного мозга).
  3. Проведено замещение повреждения спинного мозга с помощью Сферогеля-Э у 37 крыс и у 8 крыс - с помощью Сферогеля-Э со стволовыми клетками
  4. Организован послеоперационный уход за оперированными животными с регулярной оценкой восстановления тактильной чувствительности и двигательной активности задних конечностей.
  5. Показано:
    - у контрольных крыс в 25% случаев после повреждения спинного мозга наблюдался гипертонус мышц задних конечностей, а в 75% случаев - параплегия задних конечностей.
    - в опытной группе I при использовании трансплантации Сферогеля-Э у 52% крыс отмечался гипертонус мышц задних конечностей и у 38% животных - реакция отталкивания на тактильное раздражение.
    - во II опытной группе при использовании Сферогеля-Э гипертонус мышц задних конечностей регистрировался у 56% крыс, реакция отталкивания задних конечностей на тактильные раздражения наблюдалась в 44% случаев. 1 крыса к концу наблюдения стала опираться на задние конечности при ходьбе.
    - в III опытной группе при использовании Сферогеля-Э с эмбриональными клетками наблюдался гипертонус мышц задних конечностей и реакция отталкивания на раздражение в 67% случаев (у 2/3 крыс).
  6. 6. Проведены гистологические и иммуногистохимические исследования с целью оценки степени восстановления участка спинного мозга крыс с трансплантированным Сферогелем-Э. Установлено, что при введении Сферогеля-Э в область повреждения спинного мозга в 54% случаев при изолировании ПЖК и в 75% случаев при изолировании Сферогеля-Э ПСО наблюдается появление клеточных элементов: отдельные компоненты микроглии, представленные небольшим количеством мелких нервных клеток и нервными волокнами. Эти клетки позитивно окрашиваются антителами к нейрон-специфическим белкам: GAP, GFAP и нейрофиламент 200.

Введение

За последние годы появилось много экспериментальных работ, посвященных исследованиям восстановительной терапии тяжелых повреждений спинного мозга с помощью замещения дефекта различными трансплантатами. В качестве трансплантатов используют неклеточные материалы - полимеризованный коллаген, матригель, полигликоевая кислота, карбониловые нити; клетки нервной ткани - шванновские, оболочечные, обонятельные, эмбриональные, а также комбинацию этих двух видов трансплантатов [1, 2, 3, 4]. Имеются исследования, в которых показано положительное влияние вещества денатурированного куриного желтка, использованного в качестве трансплантата, на процессы регенерации и выживаемости нейронов при травме спинного мозга [5]. Обнадеживающие результаты получены при использовании гетерогенного гидрогеля PHPMA для восстановления дефекта и регенерации аксонов после повреждения спинного мозга крыс Sprague-Dawley [6].

Настоящее исследование посвящено разработке метода восстановительной терапии тяжелых повреждений спинного мозга с использованием в качестве трансплантата нового отечественного препарата "Сферогель-Э". Для оценки процессов регенерации нейронов и микрососудов в зоне трансплантации проводятся иммуногистохимические исследования.

Восстановительная терапия тяжелых повреждений спинного мозга крыс с использованием препарата СФЕРОГЕЛЬ-Э"

I. Модель острой травмы спинного мозга.

В соответствии с задачами исследования, на 7 крысах была освоена методика хирургического повреждения спинного мозга крыс (острая модель повреждения спинного мозга) путем удаления участка спинного мозга после рассечения на уровне 10 позвонка грудного отдела позвоночника, согласно работам S. Woerly et al [6, 7].
Подопытные животные. Для экспериментального повреждения спинного мозга были использованы половозрелые беспородные крысы-самки массой тела не менее 300 гр.
За сутки до операции крысам вводили профилактическую дозу антибиотика энрофлон (5% раствор энрофлоксацина, ООО "ВИК- здоровье животных", Россия), по 0,1 мл и викасол по 0,02 мл внутримышечно (в/м) однократно, а также животных не кормили.
Анестезия осуществлялась в/м введением 1 мл на животное смеси, состоящей из 2% раствора ксилазина - 0,18 мл + 10% раствора кетамина (Ketamine,alfasan, Woerden-Holland) - 0,36 мл и 0,5% раствора новокаина - 0,46 мл.
Подготовка к операции. Операции проводились в условиях стерильного бокса, в ламинаре (рис. 1а). Волосяной покров на спине животного обрабатывали специализированным предоперационным шампунем для животных с антисептическим и противопаразитарным эффектами (NYLAR Zoo Shampoo, Bio-Derm Laboratories, USA). Операционное поле выбривали от лопаток до середины поясничного отдела - по длине и на уровне середины ребер справа и слева - по ширине (рис. 1б). Животное фиксировали на операционном столике. Зону операционного поля обрабатывали 70% этиловым спиртом двукратно и изолировали с помощью стерильных салфеток, прикрепляемых к коже цапками (рис. 1в).
Ход операции: Кожу рассекали по спине, продольно, над позвоночником от 9 грудного до 11 поясничного позвонков (рис. 2а). Подкожные фасции отделяли ножницами по уровню кожного разреза. С двух сторон от остистого отростка 10 грудного позвонка (Т10), вплотную к нему выполняли 2 параллельных разреза длиной приблизительно 15 мм, отделяя мышцы от поверхности позвонка (рис. 2б).
Остистый отросток позвонка Т10 захватывали гемостатическим пинцетом и вводили сосудистые ножницы под каудальные соединительные отростки Т10. Сосудистыми ножницами рассекали дугу позвонка слева и справа от остистого отростка. Отделяли костный фрагмент и открывали прямой доступ к спинному мозгу (рис. 2в).
Раневую поверхность орошали смесью 0,5% новокаина с 0,5% лидокаином (Egis, Венгрия).
Спинной мозг пересекали одноразовым лезвием скальпеля "Paragon" (США). Кровотечение из крупных сосудов останавливали гемостатической коллагеновой губкой (ОАО Лужский завод "БЕЛКОЗИН", Россия) (рис. 2в). После остановки кровотечения отсекали фрагмент спинного мозга длиной приблизительно 2 мм.
После полного гемостаза образовавшийся дефект спинного мозга заполняли гемостатической губкой. Сверху прилегающие участки спинного мозга изолировали от окружающих тканей подкожно-жировой клетчаткой (ПЖК).
Глубокие слои мышц ушивали кетгутом №1 простым скорняжным швом. Поверхностные мышцы и фасции ушивали кетгутом №1 простым скорняжным швом, наглухо. Кожу ушивали шелком №4 прерывистым узловатым швом.
Непосредственно после операции зону операционного шва и прилегающие участки кожи обрабатывали спреем "Террамицин" (Terramycin Aerosol Spray, Pfizer Limited, England) однократно (рис. 4а). В течение 24 часов животных держали при температуре 32° С для предотвращения переохлаждения, в последующий период наблюдения крысы содержались в стандартных условиях вивария ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РОНЦ (рис. 4б). После пробуждения животного регистрировали наличие полного поперечного повреждения спинного мозга (плегия задних конечностей).

II. Использование препарата "СФЕРОГЕЛЬ-Э" в восстановительной терапии при острой экспериментальной травме спинного мозга крыс

Подопытные животные. В эксперименте были использованы половозрелые беспородные крысы-самки массой тела не менее 300 гр.
Трансплантат. Препарат "Сферогель-Э" - получен 18.02.2003 года из клиники восстановительной интервенционной неврологии и терапии, возглавляемой профессором А.С.Брюховецким.
Эмбриональные клетки: нейроны и глиальные клетки - получены 18.03.2003 года из лаборатории иммунохимии Государственного научного центра социальной и судебной психиатрии им. В.П.Сербского (ксерокопия паспорта прилагается). Клетки отцентрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин в культуральном боксе. Удалили надосадочную жидкость серологической пипеткой до 1 мл. Остаточные клетки были ресуспендированы в 1 мл. Клетки внедряли в сферогель путем наслаивания и последующего центрифугирования при 1000 об/мин в течение 10 мин при температуре +10°С непосредственно перед трансплантацией и вводили в количестве 250 тыс/животное.
Искусственная полимерная спинномозговая оболочка - получена 10.03.2003 года из клиники восстановительной интервенционной неврологии и терапии, возглавляемой профессором А.С.Брюховецким.
Анестезия осуществлялась в/м введением 1 мл смеси, состоящей из 2% раствора ксилазина - 0,18 мл + 10% раствора кетамина - 0,36 мл и 0,5% раствора новокаина - 0,46 мл.
При необходимости наркоз усиливали ингаляцией медицинского эфира.
Операцию проводили по описанной выше методике. Травму спинного мозга наносили путем его полного поперечного пересечения с иссечением блока спинного мозга на протяжении 2-3 мм (на уровне Т10-Т11 позвонков). После пробуждения животного регистрировали наличие полного поперечного повреждения спинного мозга (плегия задних конечностей).
Группы животных. Животные были разделены на четыре группы: контроль и три опытные группы. В контрольной группе дефект спинного мозга пассивно заполнялся сгустком крови и изолировался от окружающих тканей пожкожно-жировой клетчаткой (ПЖК).
В двух опытных группах после полного гемостаза образовавшийся дефект спинного мозга заполняли препаратом Сферогель-Э, либо Сферогель-Э + эмбриональные клетки (нейроны и глиальные клетки). Имплантат Сферогеля-Э формировали так, чтобы он соответствовал по объему и по форме области поврежденного спинного мозга и заполняли полость раны, обеспечивая полное соприкосновение полимерной поверхности с поверхностями перерезанного спинного мозга. Сверху область введения препарата и прилегающие к ней участки спинного мозга изолировали от окружающих тканей ПЖК, как и в контроле. В третьей (опытной) группе Сферогель-Э помещался в сформированный канал из полимерной спинномозговой оболочки (СМО).
Послеоперационный уход.
В течение 3 дней после проведения операции, с целью предотвращения отека мозга и предотвращения обезвоживания организма, животным вводили подкожно по 3 мл смесь, состоящую из 200 частей 5% глюкозы и 1 части дексаметазона (Dexametason, Warzawskie Zarlady Farmaceutyczne Polfa).
Непосредственно после операции, для предотвращения инфекции мочевыводящих путей крысам проводили курс антибактериальной терапии: 0,1 мл энрофлон 5% в/м 1 раз в день в течение 10 дней ежедневно. С целью профилактики гиповитаминоза и облегчения протекания послеоперационного периода
проводили терапию препаратом тривит (масляный раствор вит. А, D, Е, ОАО Мосагроген, Москва) по 0,1 мл/животное один раз в день в течение 10 дней и вводили 0,5% раствор глюкозы 1 мл п/к ежедневно в течение 10 дней. По показаниям (развитие гиповитаминоза, трофические изменения) через 3 недели после проведенной терапии курс введения препаратов повторили.
Осмотр оперированных животных проводили ежедневно в течение 2 месяцев до момента забоя. Мочу спускали дважды в день, в 9.00 час и 20.00 час.
Трофические нарушения оценивались по общему виду крыс, потере массы тела, состоянию волосяного покрова, наличию пролежней.
Восстановление нервной проводимости оценивали по тонусу мышц и появлению двигательной активности задних конечностей, реакции на болевую и тактильную чувствительность.

Результаты исследования.

Для определения возможности использования препарата Сферогель-Э в качестве трансплантата при острых травмах спинного мозга крыс было проведено 65 операций ляминэктомии на уровне позвонка Т10 на беспородных крысах-самках (рис.5).
Из всех прооперированных крыс - 20 контрольным животным не производили трансплантацию препарата Сферогель-Э в область повреждения спинного мозга. В 25 случаях (II группа) Сферогель-Э изолировали от окружающих тканей подкожно-жировой клетчаткой, 12 крысам после повреждения спинного мозга создавали канал из полимерной спинномозговой оболочки, в который помещали Сферогель-Э (II группа). 8 крысам вводили Сферогель-Э со стволовыми клетками также в канал, сформированный полимерной спинномозговой оболочкой (III группа).



Рис. 5. Количество оперированных крыс в различных группах опыта.



Рис. 6. Количество крыс, включенных в оценку двигательной активности в различных группах опыта

Изменения двигательной функции задних конечностей.

В контрольной группе 5 крыс (25%) не вышли из наркоза после проведения операции из-за массивной кровопотери и индивидуальной непереносимости наркоза. У 15 крыс после опреации крыс зарегистрирована параплегия задних конечностей. Погибло в течение первых 4-6 часов после проведения операции. 3 крысы погибли на 3-4 сутки от манифестно развившейся пневмонии (табл. 1).
В группах с трансплантированным Сферогелем-Э не вышли из наркоза 16% крыс (трансплантат укрыт подкожно-жировой клетчаткой), 25% крыс - после операций с использованием полимерной спинномозговой оболочки и 38% крыс - после операций с применением Сферогеля-Э и эмбриональных клеток.

Таблица 1
Количество выживших и погибших беспородных крыс-самок после операции ляминэктомии на уровне Т10 с трансплантацией препарата Сферогель-Э

Группы Кол-во проопери- рованных / выживших животных Количество погибших крыс
Не вышли из наркоза в 1-9 сутки после операции в отдаленные сроки наблюдения
кол-во дни гибели
Контроль 20 / 12 5 (25%) 3 (15%) 4 (20%) 20,30,33,59
Сферогель-Э (изолирование ПЖК) 25 / 21 4 (16%) - 2 (8%) 21,45
Сферогель-Э (изолирование ПСО) 12 / 9 3 (25%) - - -
Сферогель-Э + эмбриональные клетки 8 / 3 3 (28%) 2 (25%) - -
Примечание:
ПЖК - подкожно-жировая клетчатка;
ПСО - полимерная спинномозговая оболочка;
(25%) - количество погибших животных в % к общему числу прооперированных крыс.

В отдаленные сроки в контрольной группе наблюдалась гибель животных от разрыва атоничного и перерастянутого, вследствие переполнения из-за воспаления мочевыводящих путей и плохой эвакуации мочи, мочевого пузыря: 4 крысы в контрольной группе (на 20, 30, 33 и 59 дни), а также 2 крысы в I опытной группе - на 21 и 45 дни.
Во время наблюдения регистрировались изменения тонуса мышц и двигательной активности задних конечностей крыс (табл. 2, рис. 7).

Таблица 2
Изменения двигательной активности беспородных крыс-самок в течение 2 месяцев после проведения операции повреждения спинного мозга на уровне позвонка Т10 и использования в качестве трансплантата препарата Сферогель-Э

Группа Гипертонус сгибателей(дни) Реакция отталкивания на тактильные раздражения(дни) Попытки использовать задние конеч-ности при передвижении(дни) Другие изменения
Контроль 3/12 (18, 24, 55) 1/12 (30) - -
Сферогель-Э (изолирование ПЖК) 11/21 (14-49)* 8/21 (21-40) 4/21 (35-54) 4/21 - align=center>слабо пытаются опираться на лапы при ходьбе2/21 - ступни развернуты вперед, шевелит пальцами.
Сферогель-Э (изолирование ПСО) 5/9 (12-54) 4/9 (22) 1/9* (25) 1/9 - ступни развернуты вперед, с 42 дня крыса использует задние лапы при ходьбе, пытается чесать ими голову
Сферогель-Э + эмбриональные клетки 2/3 (21) 3/3 (21-41) - -
Примечание:
ПЖК - подкожно-жировая клетчатка;
ПСО - полимерная спинномозговая оболочка;
* - в скобках



Рис. 7. Изменения двигательной функции задних конечностей крыс в течение 2 месяцев после операции повреждения спинного мозга и использования препарата Сферогель-Э (в группе Сферогель-Э + эмбриональные клетки - 3 крысы)

В контрольной группе у 9/12 крыс (75%) наблюдалась параплегия задних конечностей (рис. 7). У 3/12 (25%) животных выявлен гипертонус мышц задних конечностей.
Клетка 13 №2 - на 55 сутки после операции выявлен гипертонус правой задней конечности
Клетка 31 №2 - на 24 сутки после операции отмечен гипертонус левой задней конечности
Клетка 32 №1 - на 18 день после операции наблюдался гипертонус правой задней конечности, на 40 сутки крыса слабо пытается отталкиваться лапой при её тактильном раздражении.
В опытной группе (I) в 48% (10/21) случаев наблюдалась параплегия задних конечностей, атония и дистрофия мышц. У 11/21 крысы (52%) выявлены изменения тонуса мышц и двигательной активности задних конечностей (рис 6):
Клетка 7 №1 - на 49 день опыта наблюдался гипертонус сгибателей обеих конечностей, реакция отталкивания на тактильное раздражение. На 54 сутки стопы задних конечностей развернуты вперёд, крыса пытается опираться на них.
Клетка 7 №2 - на 49 день опыта наблюдался гипертонус сгибателей обеих конечностей, реакция отталкивания на тактильное раздражение, которая незначительно усилилась в более поздние сроки наблюдения.
Клетка 9 №1 - на 34 день после операции наблюдался гипертонус сгибателей задних конечностей, слабая реакция отталкивания на тактильное раздражение, сохраняющаяся при дальнейшем наблюдении.
Клетка 10 №2 - на 21 день после операции выявлен гипертонус сгибателей задних конечностей, слабая реакция отталкивания на тактильное раздражение. В последующие сроки - без динамики.
Клетка 14 №1 - на 30 день опыта отмечался гипертонус сгибателей левой лапы. Динамики нет.
Клетка 16 №1- на 30 день опыта выявлен гипертонус сгибателей правой лапы. Динамики нет.
Клетка 17 №1- на 24 день после операции тонус мышц задних конечностей повысился, крыса хорошо отталкивалась лапами при их тактильном раздражении. В последующие сроки (35 день наблюдения) - редкие слабые попытки опираться на лапы при передвижении.
Клетка 17 №2 - на 24 день после операции отмечались сильные отталкивающие движения задних лап при тактильном раздражении. На 30 день крыса пытается использовать задние лапы при движениях.
Клетка 18 №1 - на 14 сутки после операции отмечался гипертонус мышц задних конечностей. На 20 день крыса хорошо отталкивалась лапами при их тактильном раздражении. На 35 день лапы развернуты вперед, крыса слабо пыталась опираться на них при ходьбе. Шевелит пальцами.
Клетка 19 №1 - На 20 день после операции отмечен гипертонус сгибателей одной лапы. На 28 день крыса активно отталкивалась лапами при их тактильном раздражении.
Клетка 19 №2 - На 20 день после операции выявлен гипертонус сгибателей одной лапы. При дальнейшем наблюдении - непроизвольные отталкивающие движения лапами при их тактильном раздражении.
В группе (II) у 2/9 крыс (22%) наблюдалась параплегия задних конечностей, атония и дистрофия мышц. У 7/9 крыс (78%) наблюдались изменения тонуса мышц и двигательной активности задних конечностей (рис.7):
Клетка 20 №1- на 48 день опыта повысился тонус мышц задних конечностей.
Клетка 22 №1 - на 12 день опыта наблюдался гипертонус мышц, с 27 дня - слабо выраженные отталкивающие движения лапами при их тактильном раздражении.
Клетка 22 №2 - на 12 день опыта наблюдался гипертонус сгибателей задних конечностей, с 25 дня - слабые отталкивающие движения лапами при их тактильном раздражении (справа>слева). С 29 дня реакция на тактильное раздражение усилилась.
Клетка 23 №2 - на 54 день после операции у крысы незначительно повысился тонус мышц задних конечностей. Динамики нет.
Клетка 24 №2 - на 40 день опыта крыса слабо отталкивалась левой лапой при тактильном раздражении. Дальнейшей динамики нет.
Клетка 24 №3 - с 22 день после операции выявлен гипертонус сгибателей задних конечностей. Динамики нет.
Клетка 29 №1- с 7 дня после операции наблюдался гипертонус сгибателей задних конечностей. На 22 день крыса отталкивалась лапами при их тактильном раздражении (справа>слева). С 25 дня - задние лапы повернуты вперед, крыса пыталась опираться на них при ходьбе. На 42 день после операции выявлена положительная динамика: крыса активно перемещалась по клетке, опираясь на задние лапы, лапы в разогнутом состоянии, тазовая часть тела значительно приподнята, пыталась использовать задние конечности при почесывании головы.
В III опытной группе у всех 3 выживших животных после операции выявили восстановление тактильной чувствительности и появление двигательной активности задних конечностей (рис. 7).
Клетка 25 №1 - на 21 день после операции крыса хорошо отталкивается задними лапами (левая > правой) при тактильном раздражении.
Клетка 26 №1 - на 40 день после операции крыса слабо отталкивалась правой лапой при тактильном раздражении.
Клетка 28 №2 - на 21 день после операции выявлен гипертонус задних конечностей, слабое отталкивание задними конечностями при тактильном раздражении, а на 41 день крыса активно отталкивается обеими лапами при их сжатии.
Таким образом, повышенный тонус мышц задних конечностей (слабо выраженный) выявлен у 25% контрольных крыс с 18 по 55 дни, при этом, гипертонус определялся у 2 крыс только на одной конечности, а у 1 крысы - на обеих конечностях (рис. 8, табл. 2). На 40 день у 1/3 крыс лапы начали реагировать на тактильные раздражения. Оба признака наблюдались у 1 крысы.
При использовании трансплантации Сферогеля-Э у 52% крыс из I опытной группы выявлялся гипертонус мышц задних конечностей разной степени выраженности (с 14 по 49 день после операции). Реакция отталкивания задних конечностей на тактильное раздражение наблюдалась у 38% животных с 21 по 40 день опыта. Отмечались слабые единичные попытки использовать при передвижении задние конечности у 4 крыс (19%) на 35-54 дни после операции. Гипертонус мышц и реакция отталкивания на раздражение проявлялись одновременно у 7 крыс.



Рис. 8. Изменения со стороны двигательной активности и мышечного тонуса задних конечностей в течение 2 месяца после операции повреждения спинного мозга и применения препарата Сферогель-Э на уровне позвонка Т10

При использовании Сферогеля-Э во II опытной группе гипертонус мышц задних конечностей начал регистрироваться с 12-54 дни у 56% крыс, реакция отталкивания задних конечностей на тактильные раздражения наблюдалась с 22 дня в 44% случаев. На 25 день 1 крыса пыталась опираться на задние конечности при ходьбе. При дальнейшем наблюдении наблюдалась положительная динамика: ступни лап развернуты вперед, при передвижении крыса опиралась на них, лапы больше разогнуты, чем в норме, тазовая область приподнята. На 42 день крыса пыталась почесывать голову. Эти данные позволяют сделать предположение о частичном восстановлении нервной проводимости. Гипертонус и реакция отталкивания на раздражение проявлялись в этой группе животных одновременно у 3 крыс.
При использовании в качестве трансплантата Сферогеля-Э со стволовыми клетками на 21 день после операции наблюдался гипертонус мышц у 2/3 крыс. С 21-41 сутки крысы реагировали отталкиванием при раздражении задних конечностей. Гипертонус и реакция отталкивания на раздражение проявлялись одновременно у 2/3 крыс.

Таблица 3
Трофические нарушения и осложнения у крыс после операции повреждения спинного мозга на уровне Т10 с трансплантацией препарата Сферогель-Э

Группы Проявления выражен- ного гиповитаминоза Наличие пролежней Прочие осложнения
Контроль 12/12 1/12 1/12 - резкий отек задних конечностей
1/12 - отгрызла задние конечности
Сферогель-Э (изолирование ПЖК) 19/21 2/21 1/ 21- резкий отек задних конечностей
1/21 - отгрызла задние конечности
Сферогель-Э (изолирование ПСО) 9/9 2/9 2/9 - резкий отек задних конечностей
2/9 - отгрызла задние конечности
Сферогель-Э + эмбриональные клетки 3/3 1/3 --
Примечание:
ПЖК - подкожно-жировая клетчатка;
ПСО - полимерная спинномозговая оболочка;
* - в скобках

Трофические изменения у крыс

Во всех группах (кроме III опытной) на фоне проведения витаминотерапии у крыс развивался гиповитаминоз. Крысы становились гиподинамичны, резко теряли в весе, наблюдалось выпадение волосяного покрова, вплоть до проплешин в области холки и поясницы, волосяной покров тусклый, взъерошенный. У 1/12 крыс в контроле развились пролежни в области бедер (табл. 3). У крыс с примененным Сферогелем-Э (изолированным подкожно-жировой клетчаткой) пролежни развились у 2/21 крыс, а при изолировании Сферогеля-Э полимерной спинномозговой оболочкой - у 2/9 крыс

Функция мочеиспускания

В контрольной и опытных группах после операции ляминэктомия на уровне позвонка Т10 у всех животных отсутствовала функция рефлекторного мочеиспускания весь период наблюдения.

Гистологические и иммуногистохимические исследования.

Методы

Гистологическое исследование
Позвоночный столб длиной 2-2,5 см, содержащий участок поврежденного спинного мозга, был фиксирован в 10% нейтральном забуференном формалине. Декальцинация образцов была проведена с использованием муравьиной кислоты, затем образцы заключались в парафин. Продольные срезы на уровне спинного мозга толщиной 4-5 мкм были окрашены гематоксилин-эозином.

Иммуногистохимическое исследование
Иммуногистохимическое исследование было проведено на срезах с парафиновых блоков толщиной 4-5 мкм с использованием стандартной иммуногистохимической реакции. Иммуногистохимическое исследование было проведено с использованием белков, характерных для нервной ткани и участвующих в процессах ее регенерации.

1. GAP-43 (neuromodulin) - нейрон-специфический белок 43, ассоциированный с ростом нейронов. Этот внутриклеточный фосфопротеин специфически локализуется в периферической и центральной нервной системе. GAP-43 - основной белок аксонального роста во время аксоногенеза и регенерации (GAP-43, Sigma, 1:160).
2. GFAP - глиальный фибриллярный кислый белок, который находят в астроцитах и глиальных клетках (GFAP, Sigma 1:80).
3. Нейрофиламент 200 - один из представителей промежуточных нейрофиламентов молекулярной массой 200кДа, локализуется в клетках и тканях нейронального происхождения (NF200, Sigma, 1:100).

Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике. Для "демаскировки" антигенов проводили прогревание срезов на водяной бане в предварительно нагретом до 95-990С 10мМ цитратном буфере (рН=6,0) в течение 30 минут. Затем стекла охлаждали при комнатной температуре в течение 15-20 минут, и переносили в фосфатный буфер на 5 минут. Для блокирования неспецифического связывания антител срезы инкубировали 15 минут с 1% раствором бычьего сывороточного альбумина. Инкубацию с первичными антителами проводили при 370С в течение 1 часа. После первичных антител стекла промывали 2 раза по 10 минут в фосфатном буфере. Иммунологическую реакцию проявляли с помощью флуоресцентного окрашивания или непрямой стрептавиади-биотин пероксидазной реакцией.
Иммунофлуоресцентное окрашивание. Инкубацию со вторыми антителами, меченными FITC [Sigma], проводили при 370С в течение 30 минут, и затем срезы промывали 2 раза по10 минут. Срезы заключались в 50% глицерин. Оценка результатов проводилась с помощью флуоресцентного микроскопа Opton [Carl Zeiss].
Непрямое пероксидазное окрашивание. Инкубация со вторыми антителами [LSABв+kit, DAKO] проводили при комнатной температуре в течение 20 минут, и затем срезы промывали 2 раза по 5 минут. Инкубация с антителами, меченными стрептавидином, [LSABв+kit, DAKO] проводили при комнатной температуре в течение 20 минут, и затем срезы промывали 3 раза по 5 минут. Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали DAB+ систему [DAKO]. Реакцию проводили в темноте в течение 5-10 минут. Срезы докрашивали гематоксилином Майера и заключали в канадский бальзам.

Результаты

На исследование поступило 39 образца, взятых через 2 месяца после операции. Из них 25 образцов подверглись гистологической и иммуногистохимической оценке (табл. 4).

Таблица 4
Количество образцов, вошедших в гистологическое исследование

Группа К-во образцов Примечание
Контроль 5 В одном случае область повреждения спинного мозга находится на границе образца. Случай в анализ не включен.
Сферогель-Э (изолирование ПЖК) 15 В трех случае область повреждения спинного мозга находится на границе образца. Эти случаи в анализ не включены.
Сферогель-Э (изолирование ПСО) 5 В одном случае область повреждения спинного мозга находится на границе образца. Случай в анализ не включен.
Сферогель-Э+эмбриональные клетки 0 Материал в работе

Контрольные образцы (количество - 4).


В месте дефекта губчатой кости и ткани спинного мозга во всех случаях определяется гранулярная ткань разной степени зрелости с ангиоматозом и скоплением гемосидерофагов, содержащих большое количество гемосидерина. В центре гранулярной ткани определяется многокамерный кистозоподобный дефект ткани, в стенках которого эпителиоидные клетки, макрофаги и гигантские многоядерные клетки типа рассасывающих инородные тела - картина неспецифического хронического гранулематозной реакции. В 2 случаях наблюдается формирование кистозообразной полости аналогичного строения, заполненной инородным веществом.
В трех образцах участки регенерации нервной ткани, располагающиеся под кистозообразным дефектом, выражены незначительно. Иммуногистохимическое исследование показало совсем незначительное окрашивание клеток антителами к нейрон-специфическим белкам (GFAP, GAP и нейрофиламент 200). В образце "клетка 32ч" под многокамерной полостью без инородного тела определяются участки ткани рыхлого строения с отсутствием крупных нейронов и клеток типа ганглиозных (Рисунок 1). В этой области обнаруживаются отдельные компоненты микроглии, представленные небольшим количеством мелких нервных клеток и хаотично ветвящимися рыхло расположенными нервными волокнами. Клетки области очень слабо окрашиваются антителами к GFAP и GAP.

Сферогель-Э изолирование ПЖК (количество - 12).


В области повреждения в 1 случаях наблюдается формирование однокамерной кистозоподобной полости, в стенках которой эпителиоидные клетки, макрофаги. На месте пересечения спинного мозга и введения Сферогеля-Э определяется плотная область по сравнению с контрольными препаратами в 6 случаях. Наблюдается более высокое количество нервных клеток и их отростков, а также полнокровие кровеносных сосудов без выхода эритроцитов за пределы сосудистого русла (Рисунок). В части препаратов (7 образцов) микрососуды - кавернозно-расширенные, тонкостенные, полнокровные. В большинстве образцов имеются обширные экстравазации и свежие кровоизлияния, возможно травматического характера. В ткани присутствует большое количество гемосидерофагов, окружающих зоны кровоизлияния. Замечено, что при использовании Сферогеля-Э, изолированного ПЖК, диаметр кровеносных микрососудов, их полнокровность и количество экстравазаций больше, чем в контроле или использовании изолирования ПСО.
Иммуногистохимическое исследование показало значительное увеличение количества GAP позитивных, и GFAP положительных клеток в 5 случаях (Рисунок ).

Сферогель-Э изолирование ПСО (количество - 4).


В области повреждения по краю спинного мозга наблюдаются инородные тела, похожие по внешнему виду на пленку. Область введения Сферогеля-Э по строению плотная, содержит большое количество мелких нервных клеток и нервных волокон. Количество клеточных элементов, длина и количество их отростков сравнимы результатами при введении Сферогеля-Э, изолированного ПЖК. Кровеносные сосуды тонкостенные, полнокровные, кавернозно-расширенные сосуды отсутствуют.
Иммуногистохимическое исследование показало присутствие белков GFAP, GAP и нейрофиламента 200 в области прорастания (Рисунок).
В одном случае наблюдается многокамерный кистозоподобный дефект ткани с инородным телом, в стенках которого эпителиоидные клетки, макрофаги и гигантские многоядерные клетки типа рассасывающих инородные тела. Ниже полости наблюдается участок повышенной плотности, похожий по строению на ткань неповрежденного спинного мозга.
Таким образом, при введении Сферогеля-Э в район острой травмы спинного мозга в 54% случаев при изолировании ПЖК и в 75% случаев при изолировании Сферогеля-Э ПСО наблюдается появление клеточных элементов: отдельные компоненты микроглии, представленные небольшим количеством мелких нервных клеток и нервными волокнами. Эти клетки позитивно окрашиваются антителами к нейрон-специфическим белкам: GAP, GFAP и нейрофиламент 200.

Выводы.

  1. Выявлено, что у контрольных крыс в 25% случаев после повреждения спинного мозга наблюдался гипертонус мышц задних конечностей, а в 75% случаев - параплегия задних конечностей.
  2. Показано, что в опытной группе I при использовании трансплантации Сферогеля-Э у 52% крыс отмечался гипертонус мышц задних конечностей и у 38% животных - реакция отталкивания на тактильное раздражение.
  3. Показано, что во II опытной группе при использовании Сферогеля-Э гипертонус мышц задних конечностей регистрировался у 56% крыс, реакция отталкивания задних конечностей на тактильные раздражения наблюдалась в 44% случаев. 1 крыса к концу наблюдения стала опираться на задние конечности при ходьбе.
  4. Показано, что в III опытной группе при использовании Сферогеля-Э с эмбриональными клетками наблюдался гипертонус мышц задних конечностей и реакция отталкивания на раздражение в 67% случаев (у 2/3 крыс).
  5. При гистологическом и иммуногистохимическом исследованиях установлено, что при введении Сферогеля-Э в область повреждения спинного мозга в 54% случаев при изолировании ПЖК и в 75% случаев при изолировании Сферогеля-Э ПСО наблюдается появление клеточных элементов: отдельные компоненты микроглии, представленные небольшим количеством мелких нервных клеток и нервными волокнами. Эти клетки позитивно окрашиваются антителами к нейрон-специфическим белкам: GAP, GFAP и нейрофиламент 200.

Список литературы

  1. Барщенко И.А., Басков А.В., Коршунов А.Г., Сатанова Ф.С. Некоторые аспекты патофизиологии травматического повреждения и регенерации спинного мозга (обзор литературы) // Вопр. Нейрохир. -2000 - №2 - с. 28-31.
  2. Guenard V., Kleiman N., Morrisey T.K. et al. Syngenetic Schwann cells derived from adult nerves seeded in semipermeable channels enhance peripheral nerve regeneration // J. Neurosci. - 1992. - Vol. 12, №9. - 3310-3320
  3. Davis G.E., Blaker S.N., Engvall E. Human amnion membrane cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation // J. Cell Biol. - 1992. -Vol. 119, №3. - P. 493-501.
  4. Ying Li, Pauline M. Field, Geoffrey Raisman Repair of adult rat cortispinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells // Science - 26 September 1997. -Vol. 277 - P. 2000-2002
  5. Сатанова Ф.С. Деструктивные и репаративные процессы при травме спинного мозга (экспериментальное исследование): дисс. канд. мед. наук - М., 1996
  6. S. Woerly, E. Pinet, L. De Robertis, M. Bousmina, G. Laroche, T. Roitback, L. Vargova, E. Sykova Heterogeneous PHPMA hydrogels for tissue repair and axonal regeneration in the injured spinal cord // J. Biomater. Sci. Polymer Edn, - 1998 - Vol. 9 - № 7 - P. 681-711
  7. S. Woerly, V. D. Doan, F. Evans-Martin, C. G. Paramore, J.D. Peduzzi Spinal cord reconstruction using NeuroGelTM implants and functional recovery after chronic injury // J. of Neurosciensce Res. - 2001 - Vol. 66 - P. 1187-1197

Спасибо, что вы посетили сайт нашей клиники!

Рак сегодня нельзя вылечить полностью, но его можно попытаться перевести в хроническое и не смертельное заболевание, увеличить продолжительность жизни пациента, улучшить качество жизни онкологического больного или обеспечить достойный человека уход из неё без унижения и мучений.

С уважением,
доктор медицинских наук
профессор
А. С. Брюховецкий

НейроВита

Адрес Клиники

Россия Москва
Каширское шоссе 23

Обратная связь

Телефон:
+7 (499) 324-9339
+7 (499) 324-9389
Факс:
+7 (499) 324-9350
Email: neurovita@mail.ru

Время работы

Администрация клиники:
Понедельник - пятница: 9:00 - 20:00
Суббота & Воскресенье: 9:00 - 16:00

Прием пациентов:
Круглосуточно